도말평판법, 연속희석법, 평판계수법 이용하여 요거트(요구르트) 속 유산균 수 세기

이번 실험은 무균대(클린벤치, 크린벤치, clean bench)에서  마이크로피펫을 이용하여 연속희석법을 사용하고, 유산균을 MRS배지에 평판도말하는 과정을 통해 자라난 집락(콜로니, colony) 개수를 세어 평판계수법을 이용해 요구르트 속 유산균 수를 세는 실험입니다. 배지를 제작하는 방법이나 마이크로미터 사용법을 잘 모르겠다면 다음의 읽고 오는 걸 추천드립니다.

마이크로미터 사용법: https://livelylifescience.tistory.com/21

미생물 배지(LB배지) 제작하기: https://livelylifescience.tistory.com/20

 

영상으로 보고 싶다면 아래 유튜브로 접속해주세요.
https://youtu.be/gfuLwed3H1E

 

실험과정

미생물 실험을 진행할 때에는 항상 무균대 안에서 소독용 알코올이 담긴 분무기를 이용하여 멸균을 한 후 진행해야 합니다.  실험에 사용할 덴마크 요구르트 음료 주변에 묻은 균으로 오염되지 않도록 소독합니다.

착용한 장갑도 소독해 줍니다.

 

에탄올이 묻은 장갑을 골고루 손을 씻듯 움직여 잘 말려줍니다. 에탄올이 잘 마르는 과정에서 소독이 됩니다. 

실험에 사용할 증류수를 비커에 담아줍니다.

10배씩 연속하여 희석하기 위해 마이크로튜브(E-tube, 1.5ml tube, 에펜도르프 튜브)를 랙에 한 칸씩 띄어 여러 개 꽂아줍니다. 사진에는 10만 배(10^5) 희석하고자 원액을 담을 마이크로튜브를 포함하여 6개를 사용하였습니다.

1000마이크로리터를 뜰 수 있는 마이크로피펫을 아용해 실험에 사용할 요구르트 1ml(1000 ㎕ )를 마이크로튜브에 옮겨줍니다.

파란색 팁을 마이크로피펫에 끼워 사용합니다.

채취할 용액에 들어갈 때에는 마이크로 피펫을 1단으로 누른 상태에서 들어갑니다.

천천히 엄지손가락에 힘을 빼 천천히 용액이 팁 안으로 들어오게 합니다.(너무 빠르면 정확한 용액을 담기 어려워요)

요구르트를 마이크로튜브에 넣습니다. 마이크로튜브에 용액을 넣는 것을 다른 말로 용액을 분주한다고 합니다.

사용한 팁은 배출버튼(eject button)을 이용하여 별도의 비커에 버립니다. 이때 팁이 튕겨나갈 수 있으니 손으로 비커 입구를 가리고 팁을 마이크로피펫에서 제거해 주세요.

이제 팁을 바꿔 증류수 900㎕(0.9ml)를 남은 마이크로튜브에 모두 담습니다.

아래 사진이 900㎕로 맞춘 것입니다. 마이크로 피펫마다 용량이 다르니 잘 확인하면서 진행해 주세요.

아까와 마찬가지로 마이크로피펫 1단으로 누른 상태에서 들어가 증류수 900㎕를 떠 남은 5개의 마이크로튜브에 모두 담습니다.

이제 연속희석법을 진행하겠습니다. 100㎕를 더 정확하게 뜨기 위해서 10-100㎕짜리 마이크로 피펫을 이용합니다.

100㎕를 맞춰줍니다.

먼저 요구르트 원액에서 100㎕를 마이크로피펫으로 채취합니다. 참고로 노란 피펫팁을 사용합니다. 

바로 옆 증류수가 900㎕ 담긴 마이크로튜브에 100㎕의 요구르트 용액을 넣은 후 피펫팅을 하여 골고루 섞어줍니다.

피펫팅이란 마이크로피펫의 용액 분주 버튼을 1단으로 눌렀다 뗐다를 반복하여 용액을 섞어주는 것을 말합니다. 1단으로 누르는 사진입니다.

누른 버튼을 떼는 사진입니다.

아래 영상을 보면 용액을 분주한 후 섞어주는 피펫팅 하는 과정을 볼 수 있습니다.

실험의 정확도를 높이기 위해 팁을 변경하였으나 팁을 변경하지 않고 그냥 진행해도 무방합니다.

이제 방금 900㎕의 증류수에 100㎕ 요구르트를 섞은 10배 희석한 용액에서 다시 100㎕를 채취하여 다른 900㎕의 증류수가 담긴 마이크로튜브에 옮겨줍니다.

용액을 분주한 후 마찬가지로 피펫팅을 하여 섞어줍니다. 그럼 또 10배 희석이 될 테니 요구르트 원액에 비해 100배 희석된 용액이 만들어졌습니다.

이렇게 10배씩 희석하는 과정(연속희석법)을 마지막 마이크로튜브까지 반복합니다.

아래는 분주하는 모습을 확대하여 보여주는 사진입니다.

마지막 마이크로튜브도 용액을 넣고 피펫팅 합니다.

연속희석법 실행 후 결과를 설명해 보겠습니다. 왼쪽의 마이크로피펫을 0번으로 하고 맨 오른쪽 마이크로 튜브를 5번이라고 한다면

0번: 요구르트 원액

1번: 요구르트 10배 희석

2번: 요구르트 100배(백배) 희석

3번: 요구르트 1000배(천배) 희석

4번: 요구르트 10000배(만배) 희석

5번: 요구르트 100000배(십만 배) 희석

이렇게 되는 것입니다.

이게 각각의 희석된 용액을 제작하였거나 구입한 MRS배지에 평판도말하겠습니다. 희석시킨 요구르트 용액에서 100㎕를 채취하여 배지에 분주합니다.

배지에 분주할 때는(용액을 부울 때는) 마이크로피펫을 2단까지 눌러 안에 있는 용액이 모두 나올 수 있도록 해주세요.

일회용 스프레더나 다회용 스프레더를 이용하여 평판도말합니다. 평판도말이라는 것은 페인트를 칠하듯 넓게 펴는 것을 얘기합니다.

마지막에 배지의 가장자리를 스프레더로 한번 훑어 테두리로 유산균들이 밀려나지 않도록 합니다. 전체적인 과정은 아래 영상으로 보여드립니다.

마찬가지로 요구르트 원액을 제외한 다른 마이크로튜브에 있는 용액들도 모두 MRS배지에다가 100㎕씩 분주하여 평판도말해 줍니다.

도말을 다 마쳤다면 실링테이프나 파라필름을 이용하여 배지를 밀봉합니다. 여기에서는 파라필름을 이용하였습니다. 실제 사용하기에는 실링테이프가 더 좋습니다.

최대한 수평으로 배지를 든 상태에서 테두리를 파라필름 혹은 실링테이프로 둘러 밀봉합니다.

그 후 네임펜으로 주기를 합니다. 무엇을 넣었는지 언제 했는지 누가 했는지 등을 작성하고 실험에 따라 내용은 달라질 수 있습니다. 배지가 담긴 플라스틱 페트리디쉬(배양접시)의 뚜껑의 가장자리나 바닥의 가장자리에다가 적습니다. 실험에 따라 적는 위치가 달라질 수 있습니다.

이제 균을 배양하고자 배지를 하나로 묶어 항온배양기에 넣고 하루 이틀 배양해 가며 중간중간 자라는 상황을 관찰합니다.

 

다른 균들이 같이 키우고 있어서 온도가 다르나 보통 유산균은 25~45 사이에서 자라나 균마다 차이가 있습니다. 저는 기존 다른 종류의 균들이 자라고 있어서 36도로 설정이 되어있는 상태입니다.

실험 결과를 보면 다음과 같이 나타납니다. 더 많이 희석될수록 콜로니 수가 적게 나옵니다. 나온 콜로니 수를 세어 유산균 수를 유추합니다.

아래부터 나오는 사진을 보면 너무 많은 콜로니(집락)가 보여 '이걸 언제... 다 세지?'라는 생각을 할 수 있습니다. 평판계수법에서는 30개~300개의 콜로니가 나오는 배지를 유의미한 값으로 보고 진행하며 300개를 초과하여 너무 콜로니가 많거나 30개보다 적은 경우 결과에서 제외하고 계산합니다.

예를 들어 100,000배(십만 배) 희석한 배지에서 콜로니가 10개가 나왔고, 10,000배(만배) 희석한 배지에서 콜로니가 90개가 나왔다고 했을 때의 원래 요구르트에 1ml(1000㎕) 당 유산균 수가 얼마나 되는지 계산을 진행해 보면 

먼저 100,000배(십만 배) 희석된 배지의 결과 나온 콜로니 개수 10개의 값에 희석된 십만 배를 곱한 값에다가(그럼 1,000,000(백만)) 처음 용액을 섞을 때 100㎕만 증류수 900㎕에 섞었으므로 우리가 구하고자 하는 값은 1000㎕ 당 유산균 수 이므로 추가로 10을 곱하면 1ml당 유산균 수가 10,000,000(천만)이 되는 것으로 계산해 낼 수 있습니다.

 

그다음 10,000(만배) 희석된 배지의 결과로 나온 콜로니 개수 90개의 값에 희석된 만 배를 곱하면 900,000이란 값이 나오고 마찬가지로 이 값은 처음 용액을 섞을 때 100㎕만 증류수 900㎕에 섞었으므로 100㎕에 들어 있는 유산균이므로 1000㎕(1ml) 당 유산균 수를 구하기 위해 다시 10을 곱하면 9,000,000이란 유산균 수를 얻을 수 있습니다.

 

따라서 십만 배 희석된 배지에서 구한 1ml(1000㎕) 당 유산균 수는 10,000,000(천만)이며, 만배 희석된 배지에서 구한 1ml(1000㎕) 당 유산균 수는 9,000,000이므로 이 둘의 평균의 9,500,000이 1ml당 들어있는 유산균 수라고 계산해 낼 수 있습니다. 

단, 평판계수법의 경우 단순 몇 개의 배지로만 계산하지 않고 30개~300개의 콜로니가 나오는 희석배수를 찾아 많은 데이터의 평균을 통해 계산해내야 합니다.

또한 배지에서 란 콜로니(집락)가 미생물 1마리가 분열하여 만들어진 것인지, 그 이상 여러 마리가 미처 퍼지지 못해 뭉쳐서 만들어진 것인지 특정할 수 없기 때문에 정확히 몇 마리라는 표현보다는 콜로니를 형성할 수 있는 유닛이란 뜻으로 마리라는 단위 대신 CFU(colony forming unit)이란 단위를 사용합니다.

우리가 사 먹는 제품들에서 마리 수란 용어를 쓰는 것은 소비자가 이해하기 편하기 때문에 사용하는 것입니다. 미생물학적으로는 CFU란 단위로 표기하는 것이 더 정확한 표현입니다. 실제 CFU로 나타낸 제품들도 있습니다.