미생물 그람염색법, 미생물 그람염색하기

그람염색법은 그람이라는 의사가 만든 염색법으로 미생물을 그람염색이 되는 종류에 따라 그람 양성균과 그람 음성균으로 나눠 분류할 수 있습니다. 세포벽이 두꺼운 그람양성균은 보라색으로, 세포벽이 얇은 그람음성균은 붉은색으로 염색되는 모습으로 균을 분류합니다.

 

영상으로 보고 싶다면 아래 유튜브로 접속해주세요.
https://youtu.be/GUV58J-2XO4

실험방법

고체 배지의 키운 균의 경우 받침 유리에 스포이트를 이용해 물을 떨어뜨려주세요.

받침 유리에 물을 떨어뜨리는 사진입니다.

 

받침유리에 물방울이 놓여있는 사진입니다.

 

고체 배지에서 자란 세균 집락(콜로니)을 일회용 루프를 이용해 살짝 콕 건드려 균을 채취합니다.

고체 배지의 세균 콜로니를 루프를 이용해 채취하는 모습입니다.

루프에 있는 균을 받침 유리에 떨어뜨린 물방울에 풀어주세요.

받침 유리 위 물방울에 루프에 있는 균을 풀어주는 사진입니다.

 

액체 배지에 있는 균의 경우 코니컬 튜브에 있는 균을 루프를 이용해 채취합니다.

액체 배지에 키운 균이 들어있는 코니컬 튜브를 여는 사진입니다.

루프를 이용해 액체배지 속 세균을 채취하는 사진입니다.

루프에 묻은 배지를 받침 유리에 툭툭 쳐서 채취한 균을 받침유리로 옮겨주세요

루프에 묻은 배지와 세균을 받침유리로 옮기는 사진입니다.

그 뒤 스포이트로 물을 떨어뜨려 균을 퍼트려주세요.

스포이트로 물을 받침유리에 떨어뜨리는 사진입니다.

알코올램프를 켜고 물방울이 마르도록 건조해 줍니다. 10분 이상(보통 실험 시간이 부족하기 때문에 오래 기다리기 어려워 다음 과정으로 넘어갑니다.)

알코올램프 불꽃에 받침유리를 왔다 갔다 하며 받침유리에 균을 고정시켜 줍니다. 이 과정을 안전하게 하기 위해서 처음에 균을 받침유리로 옮길 때 중간보다 살짝 한쪽으로 치우쳐서 옮겨주세요. 나무집게를 이용해도 좋습니다.

너무 천천히 불 위로 왔다갔다 해버리면 받침유리가 깨질 수 있으니 불꽃에 너무 오래 닿지 않게 해 주세요.

물기가 다 날아갔으면 알코올램프를 끄면 됩니다. 너무 오래 고정시키면 세균이 수축해서 관찰하기 어려워집니다.

그람염색하기

크리스털 바이올렛 염색약을 받침 유리에 고정시킨 세균 위로 떨어뜨린 후 2~3분 정도 염색시켜 줍니다.

염색 후 이면수세를 실시합니다. 이면수세라는 건 염색약을 떨어뜨린 부분 말고 그 뒷면에 물을 흘려 받침유리를 씻어내는 과정을 말합니다. ★물줄기를 균이 있는 부분에 직접적으로 가하면 균이 떨어져 나가므로 꼭 이면수세 해주세요. 

균이 있는 부분 말고 그 뒷면에 물을 흘려주는 것입니다.

이면수세 해주세요. 물줄기를 더 가늘게 해서 진행해도 됩니다. 

아래 사진 보다 보라색이 더 없어질 때까지 이면수세 해주세요.

균을 떨어뜨린 부분을 제외하고 주변 물기를 거름종이를 이용해 제거해 주세요.

그다음 받침유리에 그람 아이오딘 용액을 떨어뜨려 세균에 염색된 크리스털 바이올렛이 더 강하게 염색되도록 해주세요. 

2~3분 기다린 후 이면수세 진행해 주세요. 실험을 진행하다보면 받침유리 어느 쪽에 균이 있는건지 까먹을 수 있으니 잘 기억하며 실험을 진행해주세요.

균이 있는 곳을 제외하고 거름종이로 물기를 제거합니다. 만약에 균이 어디 있는지 잘 모르겠으면 거름종이로 살짝 닦아보세요. 지워지는 부분이 균이 있는 면입니다. 

탈색제 용액을 떨어뜨려 크리스털 바이올렛(보라색) 염색약을 탈색시킵니다. 보라색이 없어지도록 탈색해 주세요. 이 과정에서 그람음성균은 보라색이 탈색되고 그람 양성균은 세포벽이 두꺼워 탈색되지 않고 보라색으로 남습니다.

거름종이에 용액을 흡수시켜 줍니다.

이면수세 해주세요.

마지막으로 사프라닌 용액을 떨어뜨린 후 2~3분 동안 염색시켜 줍니다.

염색 후 이면수세 진행합니다.

주변 물기를 닦아낸 후 관찰을 실시합니다. 덮개유리를 핀셋을 이용해 덮어주세요. 균이 있는 곳에 물기가 없으면 물방울을 추가로 떨어뜨려도 됩니다.

광학현미경을 이용해 관찰합니다.

 

상을 잡을 때 덮개유리 테두리를 갖고 잡으면 훨씬 수월합니다.

 

600배로 확대한 사진입니다. 사진 속 균은 구균입니다. 정말 작은 균들이라 많이 확대해도 이 정도밖에 안보입니다. 입 속 세균을 고체배지에 키운 후 관찰한 것이라 정확한 균을 특정하긴 어렵고 그람양성균정도로 보입니다.

400배로 관찰한 모습입니다.

실제 실험을 해보면 실험 과정에 따라 그람양성균이 그람음성균으로 판별될 수 있습니다. 따라서 생물나라 사이트 같은 곳에서 대장균이나 황색포도상구균 같이 결과가 이미 정해져 있는 균을 갖고 실험을 하여 실험 과정이 잘 되었는지 판별해 보는 것도 좋은 방법입니다.

실험에 사용한 그람염색세트는 생물나라에서 찾을 수 있습니다.