미생물 배지 만들기(LB배지, 고압 멸균기(auto clave),클린 벤치(clean bench))

고압멸균기(오토클레이브)와 무균대(클린벤치)를 이용해 미생물 배지를 만드는 실험입니다. 생명 과학 실험에 관심 있는 학생들과 생명과학 실험 추천받고자 하는 학생들을 위해 제작하였습니다. 

과정을 동영상으로 보고 싶은 분들은 아래 링크로 접속바랍니다.

https://youtu.be/s1uI0bnGXiE

 

먼저 배지 가루의 양을 재기 위해서 약포지를 X자로 접어주세요.

실험실에 웨잉디쉬가 있다면 웨잉디쉬를 사용해도 좋습니다.

전자저울의 ON/OFF 버튼을 눌러 전원을 켜주세요.

약포지를 올려놓으면 무게가 올라가게 됩니다. 그 상태에서 TARE 버튼을 눌러 0g이 되도록 만들어주세요.

꼭 반드시 전자저울의 단위가 'g(그램)'으로 되어 있는지 확인하고 진행해 주세요.

미생물 배지 중 일반적으로 사용되는 LB배지를 사용하겠습니다. 가장 먼저 보이는 배지 가루(LB Broth)는 agar라고 굳는 물질이 안 들어 있어 액체 배지를 만들 때 사용합니다. 이 배지 가루에 agar를 넣어서 고체 배지를 만들 수 도 있습니다. 

아래 제품은 배지 가루(LB Broth)에 agar가 비율에 맞게 섞여 있는 제품입니다. 해당 제품을 이용하면 고체 LB배지를 만들 수 있습니다.

중요★ 배지 용기에 붙어 있는 설명을 보면 배지들 마다 만들 때 비율이 적혀있습니다. 빨간 글씨 부분 보면 40g/L라고 되어 있습니다. 이는 1L의 배지를 만들러면 배지 가루 40g을 넣어야 한다는 의미입니다.

예시로 고체 LB배지 100ml를 만들겠습니다. 보통 100ml를 만들면 90mm 패트리디쉬 3~4개 분량의 배지를 얻을 수 있습니다. 

 

먼저 증류수 100ml를 눈금실린더를 이용해 담습니다.

전자저울을 이용해 배지 가루 4g을 준비합니다.

약포지에 있는 배지 가루를 삼각플라스크에 담습니다. 만드는 배지 전체 양에 3~5배 정도 되는 플라스크를 사용해 주어야 고압멸균 시 배지가 밖으로 끓어 넘치지 않습니다. 그래서 아래 사진에 500ml 삼각플라스크를 이용하였습니다.

약포지를 손가락으로 쳐 남은 가루가 삼각플라스크로 들어가게 합니다.

증류수 100ml를 삼각플라스크에 넣습니다. 고압멸균시 끓으면서 잘 섞이므로 교반기를 사용하지 않아도 됩니다. 양이 많아지면 교반기를 사용하면 배지 가루가 뭉치는 것을 방지할 수 있습니다.

포일을 두 겹으로 접어 입구를 헐렁하게 막아줍니다.

포일이 들썩들썩 움직이도록 살짝만 눌러주세요. 끓을 때 김이 빠져나가도록 하기 위해서입니다.

고압 멸균이 스위치를 켭니다.

뚜껑 레버를 돌려 고압멸균기를 엽니다. 

안에 있는 체바구니를 꺼내어 삼각 플라스크를 넣습니다.

다시 체바구니를 고압멸균기 안에 넣습니다.

뚜껑과 맞닿는 부분에 물기가 있다면 닦아 낸 후 진행해 주세요.

뚜껑을 레버를 돌려 꽉 닫아줍니다.

START버튼을 2초 정도 꾹 누르면 작동합니다. 더 자세한 내용은 다음 글을 참고해 주세요

[생명과학 실험] 고압 멸균기(오토클레이브, autoclave) 사용 법

121도가 되면 15분 타이머가 작동하여 멸균됩니다.

멸균이 끝나면 마치 밥솥에서 김이 나오듯이 뜨거운 김이 나옵니다. 근처에 있지 않도록 조심해 주세요. 냄새가 나니 환기도 필수로 해주세요.

멸균이 끝나고 기압계의 바늘이 0을 가리키면 뚜껑을 열어 안에 멸균된 배지를 꺼냅니다.

뜨거우니 내열장갑을 반드시 착용해 주세요!!

다 녹은 것을 볼 수 있습니다. 멸균된 배지가 든 삼각플라스크를 무균대(클린 벤치) 안에 넣고 식힙니다.

무균대(클린 벤치)에서 실험을 진행할 때에는 아래처럼 조명(형광등)을 켜고 바람을 2단으로 켠 후 장갑 낀 손을 넣어 진행해 주세요. 더 자세한 사용법은 다음 글을 참고해 주세요

[생명과학 실험] 무균대(클린 벤치, clean bench) 사용법

미생물 실험에서 중요한 것은 다른 균으로 인한 오염을 막는 것입니다. 소독용 에탄올이 든 분무기를 이용해 손과 주변을 소독해 주세요.

배지가 든 삼각플라스트를 손으로 잡을 만하면(약 40도) 진행하면 됩니다. 너무 뜨거울 때 실험을 진행하면 손에 화상 입으니까 조심하세요.

페트리디쉬가 든 비닐을 뜯습니다. 뜯는 부위가 화살표로 표시되어 있으니 꼭 클린 벤치 안에서 화살표 잘 보고 뜯어주세요. 이미 멸균되어 판매되는 제품이므로 밖에서 뜯어버리면 멸균을 잃어서 실험에 사용하게 어려워집니다.

페트리디쉬를 꺼낼 수 있을 만큼 뜯은 후 하나씩 꺼내 사용합니다.

살짝 더 크고 깊이가 얕은 부분이 뚜껑입니다.

삼각플라스크를 들어 안에 멸균된 배지를 페트리디쉬에 부어주세요.

다 부운 배지를 한쪽으로 옮긴 후 뚜껑을 절반만 걸쳐 식혀줍니다.

실험에 따라 다르나 보통의 경우 페트리디쉬에 절만 정도 오게 부어주면 별 무리 없이 실험을 진행할 수 있습니다.

배지를 다 부었다면 삼각플라스크를 꺼내 안에 남은 배지가 굳기 전에 빠른 시간 안에 세척해 주세요. 

배지를 식힐 때는 바람은 1단으로 켜주고 자외선을 켜줍니다. 조명(형광등)은 끄고 근처에 있지 않습니다. 자외선을 오래 받는 것은 건강에 해롭습니다.

40~50분 정도 흐른 후 충분히 배지가 식었다면 바로 실험하지 않는 경우 실링테이프를 이용해 배지를 밀봉하여 보관해 줍니다. 자외선(UV)을 끄고 형광등을 켠 후 바람을 2단으로 켠 후 밀봉 과정에 들어갑니다.

소독용 에탄올 분무기로 항상 장갑 낀 손을 소독한 후 진행해 주세요.

가장 앞쪽에 있는 뚜껑부터 닫아줍니다. 멀리 있는 배지부터 닫게 되면 앞에 있는 배지에 실험복 소매에 있는 균이 떨어져 오염될 수 있습니다.

실링테이프를 뜯어 천천히 늘리면서 배지 주변을 2번 정도 감아줍니다. 

마지막엔 잡아 뜯으면 실링테이프가 뜯깁니다. 실제 실험을 처치한 후에 실링테이프로 밀봉할 때에는 위 사진처럼 배지를 기울이지 말고 최대한 배지를 수평으로 둔 상태에서 밀봉하는 것이 좋습니다.

다 끝나고 보관할 때에는 자외선만 켜고 조명과 바람을 끝 상태로 보관하면 됩니다.

배지를 모두 사용하였고 무균대(클린 벤치) 사용이 종료된 후에는 전원 스위치도 꺼놔 주세요.

해당 실험 기기에 더 자세한 사용법이 궁금하시면 다음 글을 참고해 주세요

[생명과학 실험] 고압 멸균기(오토클레이브, autoclave) 사용 법

[생명과학 실험] 무균대(클린 벤치, clean bench) 사용법

 

[생명과학 실험]무균대(클린 벤치, clean bench) 사용법

 

[생명과학 실험]고압 멸균기(오토클레이브,autoclave)사용 법