플라스미드 DNA 추출하기

많은 세균들은 자신의 주 DNA 이외에 플라스미드(plasmid)라고 불리는 작은 고리 모양의 DNA를 가집니다. 플라스미드 DNA는 세균의 성장에 필수적이지는 않지만 스스로 자기복제가 가능하며 항생제 저항성 유전자를 포함하기도 하죠. 

플라스미드 DNA는 크기가 작아서 세포 밖으로 분리되기 쉽고, 조작하여 세포 내로 쉽게 도입될 수 있어서 유전자 운반체(vector)로 사용하기에 적당하여 생명공학 기술인 DNA 재조합에 많이 이용되고 있습니다.

 

영상으로 보고 싶다면 아래 유튜브로 접속해주세요.
https://youtu.be/6wCAyXteNSM

실험방법

요약본

1. 대장균을 원심분리하여 농축하고 상층액을 버린다.

2. S1용액을 넣고 균을 풀어준다.

3. S2용액을 넣고 마이크로튜브(1.5ml 튜브, e-튜브, 에펜튜브)를 4~5회 위아래 뒤집어 섞는다.

4. S3용액을 넣고 마이크로튜브를 4~6회 위아래 뒤집어 섞는다.

5.원심분리하고 상층액을 SV column에 옮긴 후 다시 원심분리한다.

6. 원심 분리 후 SV column 아래의 collecting 튜브에 남은 용액을 버리고 다시 column 튜브에 낀다.

7. AW 용액을 넣고 1분동안 원심분리한다.

8. PW 용액을 넣고 1분동안 원심분리한다.

9. SV column 튜브를 새로운 1.5ml 마이크로튜브 위에 꽂는다.

10. 50㎕의 EB 완충 용액을 넣고 1분간 세워놓은 후 원심분리하면 

11.  추출된 플라스미드 DNA와 Safe shine blue 용액을 섞어 전기영동한다.

 

 

실험과정

대장균 용액에서 1ml를 마이크로피펫을 이용해 마이크로 튜브로 옮긴다.

 

10000rpm의 속도로 1분간 원심분리한다.
빈 마이크로 튜브를 넣어 균형을 맞춰 사용해주세요.

 

원심분리 후 상층액은 버리고 다시 대장균 용액 1ml을 넣고 원심분리와 상층액 제거를 반복해주세요.

총 5번 작업해주세요.

 

마이크로튜브에 S1 완충 용액 250㎕를 넣어주세요.

 

혼합기(vortex)를 사용하여 바닥에 붙은 균을 풀어주세요.

 

S1 용액의 조성 및 역할입니다.
50mM glucose: 세포 외형 유지, 25mM tris-HCl(pH 8.0): 완충 용액, 10mM EDTA: 세균의 세포벽 약화

 

S2 완충 용액 250㎕를 튜브에 넣습니다.

 

조심스럽게 튜브를 4~5회 위 아래로 뒤집어 섞어주세요.

용액이 맑아지면 다음 단계로 넘어갑니다.

 

S2 용액의 조성 및 역할입니다.
0.2M NaOH : DNA 및 단백질 변성.
1.0% SDS : 계면활성제로 세포막을 부수는 역할.

 

350 ㎕ 의 S3 완충 용액을 첨가한 후 즉시 튜브를 4내지 6회 위아래로 뒤집어주세요.

 

S3 용액의 조성 및 역할입니다.
조성: 60ml 5M 아세트산칼륨, 11.5ml 빙초산, 29.5ml 물
역할: 산성을 띠어 변성된 플라스미드 DNA를 재생시킨다.
주 DNA와 단백질은 재생이 잘 안되나 플라스미드 DNA는 쉽게 재생되는 점을 이용함.

 

13000rpm에서 10분 동안 원심분리기를 사용하여 상층액이 생기도록 가라앉혀 주세요.

 

SV column 튜브에 상층액을 옮겨주세요.
아래 침전물이 들어가지 않게 해주세요.

 

SV column 튜브를 13000rpm에서 1분 동안 원심 분리한다.

 

 

원심 분리 후 SV column 아래의 collecting 튜브에 남은 용액을 버리고 다시 column 튜브에 껴주세요.

 

그 다음 500㎕의 AW용액을 넣고 1분동안 원심분리합니다.
선택사항이나 해주는 것을 추천합니다.
AW용액은 대장균(EndA+ 계통)에 있는 핵산가수분해효소를 불활성화시킵니다.
우리가 사용하는 대장균은 EndA-계통이라 넘어갈 순 있어요.

 

그 다음 700㎕의 PW완충 용액을 넣고 1분동안 원심분리 합니다.

 

남아있는 wash 완충 용액을 제거하기 위해 추가적으로 1분간 원심 분리한다.

 

SV column 튜브를 새로운 1.5ml 마이크로튜브 위에 꽂는다.

 

 

50 ㎕ 의 EB 완충 용액을 넣고 1분간 세워 놔주세요.

 

column의 중앙에 있는 흰 필터부분에 정확히 분주하며, 피펫 팁이 닿지 않도록 조심해야 합니다.

1분간 세워 놓고 난 후, 1분 동안 원심 분리합니다.

 

파라필름 위에서 플라스미드 DNA 10㎕를 올려놓습니다.

 

Safe shine blue 용액 4㎕를 파라필름 위에 올립니다.

 

 

Safe shine blue 용액 4㎕와 DNA 10㎕를 섞어주세요.

Safe shine blue용액은 DNA에 결합하여 자외선에서 DNA가 빛이나도록 하고,

well로 분주되었을 때 DNA가 밑으로 가라앉도록 하는 작용을 합니다.

 

마이크로 피펫을 이용하여 시료들을 순서대로 14마이크로리터씩 각각 웰에 분주해주세요. 웰에 분주하는 것을 로딩한다고 표현합니다.

 

(+)극으로 이동합니다.

 

밝게 빛나는 밴드가 바로 추출된 플라스미드입니다.

 

이상 대장균 속 플라스미드 DNA를 추출하여 전기영동을 통해 확인해보는 실험이였습니다.